среда, 9 декабря 2015 г.
Доповідь з теми дослідження.
Слайд 1
Доброго дня шановна комісія!
Вашій увазі надаються
результати досліджень, які проводяться з 2014 року на базі лабораторії мікроклонального
розмноження Глухівської дослідної станції луб’яних культур Інституту
сільського господарства Північного Сходу Нац. академії аграрних наук України.
Слайд 2
Вважаючи на актуальність картоплярства і враховуючи
сортову специфіку, потребують оптимізації процеси морфогенезу на певних етапах
технології мікроклонального розмноження картоплі, що й стала темою нашої роботи–
«Особливості
морфогенезу картоплі при дії фітогармонів in vitro»
Слайд 3
Метою роботи: дослідити особливості морфогенезу картоплі
in vitro при дії регуляторів росту живильного середовища.
Слайд 4
Об’єкт: процеси
морфогенезу рослин картоплі in vitro.
Предмет: фактори, що детермінують процеси морфогенезу картоплі in vitro .
Слайд 5
Для досягнення поставленої мети були визначені такі завдання:
1.
Проаналізувати
теоретичні засади морфогенезу картоплі in vitro на
основі даних сучасної фізіології і біотехнології рослин.
2. Висвітлити вплив фітогормонів на різних етапах мікроклонального розмноження
рослин. Визначити
ефективні концентрації регуляторів росту на різних
етапах мікроклонального розмноження картоплі in vitro.
3. Дослідити особливості морфогенезу картоплі на різних
етапах клонального мікророзмноження ін. вітро.
Слайд 6
У процесі теоретичного вивчення проблеми і
дослідно-експериментальної роботи застосовувалися методи дослідження:
– теоретичні: аналіз літератури,
інструктивно-методичних документів з біотехнології, фізіології рослин,
ботаніки; теоретичне узагальнення та осмислення здобутих експериментальних
даних, їх порівняння, класифікація та
аналіз; конкретизація та систематизація теоретичних знань для розробки завдань
дослідження; порівняльний аналіз;
– емпіричні: експериментальні
(лабораторний експеримент). З використанням лабораторних методів введення в
культуру, мікророзмноження рослин.
Слайд 7
Наукова новизна
одержаних результатів. Вперше для конкретних генотипів (сортів картоплі Косень-95 та Слов'янка) відмічено
аномальний ріст рослин деяких мікроклінів в умовах дисбалансу фітогормонів, що
виявлялось в утворенні наростів на жилках стебел і листків, у відхиленнях в морфології кореневої системи. Рослини з
наростами деформовані, ріст припиняється, листки можуть обламуватись, значно
знижується коефіцієнт розмноження таких рослин. Припускаємо, що причинами описаних аномалій можуть бути: 1)
дисбаланс фітогормонів в живильному середовищі; 2) ендофітні бактерії, які
можуть залишатись після стерилізації експлантатів під час ініціації культури in vitro і накопичуватись в рослинах при мікроклонуванні.
Слайд 8
Практичне значення одержаних результатів. Запропоновано оптимальне застосування ауксинів (ІОК), що дає змогу прискорити процеси, які лежать в основі морфогенезу рослин картоплі.
Картопля – одна з найважливіших
сільськогосподарських культур, що має важливе продовольче, кормове та технічне
значення. За вмістом деяких вітамінів картопля перевищує ряд овочевих культур.
З одиниці площі картопля дає значно більше поживних речовин, ніж овочеві, та
перевищує їх за калорійністю. Вона використовується на виробництво крохмалю,
декстрину, патоки, глюкози, спирту.
Процеси росту і розвитку різних частин рослини взаємопов’язані між собою.
Завдяки діяльності апікальної меристеми відбувається ріст стебла у довжину, надалі
збільшується його міцність і товщина (результат камбіальної активності), що
дозволяє всьому пагону витримувати значні механічні навантаження.
Рослинна клітина здатна синтезувати хімічні речовини – фітогормони (це хімічні сполуки, що виробляються в рослинах і регулюють їх ріст і
розвиток). Маніпуляції з
концентраціями фітогормонів в живильному середовищі дозволяє впливати на
процеси морфогенезу. Це ми й здійснювали в своїй роботі.
Живильне середовище – головний фактор, що обумовлює
успіх мікроклонального розмноження. Основою усіх середовищ є мінеральні солі,
які містять необхідні для росту рослин макро- (N, Р, К, Са, Mg, S) і
мікроелементи (Fe, В, Mn, Zn, Cu, Na, Co, Mo, CI, Ni). Крім того, до їх складу
входять вітаміни, амінокислоти, синтетичні регулятори росту рослин.
Слайд 9
Перед роботою прибраний і вимитий бокс опромінювали бактерицидними лампами
не менше двох годин. За годину до роботи лампи виключали, щоб повітря
звільнилось від накопиченого озону та окису Нітрогену.
До роботи залучали стерильні інструменти, живильні середовища, паростки.
Стерилізацію інструментів і матеріалів (скальпель,
голки, чашки Петрі тощо) проводили у сушильній шафі за температури 130 –
150°С впродовж двох годин, помістивши їх в металеві коробки. Під час роботи
після кожного використання інструменту його стерилізували, опускаючи в посудину
зі спиртом і прожарюючи на полум’ї спиртівки 30 – 60 секунд.
Живильне середовище та бідистилят для роботи стерилізували в автоклаві з
тиском 1,1 атм. протягом 45 хв. Перед початком і в процесі роботи руки
регулярно стерилізували спиртом. Під час роботи одягали стерильний халат,
шапочку та змінне взуття.
Для виділення меристеми використовували зрізані верхівки паростків (довжиною
2-3 см) з бульб, що пройшли термотерапію, їх стерилізували в 0,1%-ному розчині
діоциду, приготованому на бідистиляті. Для цього паростки опускали у розчин на
3 – 5 хв., потім тричі промивали стерильним бідистилятом. В чашку Петрі з
дезінфікованими паростками додавали кілька крапель стерильної води для
попередження підсихання.
Виділяли меристеми під бінокулярним мікроскопом з масштабною сіткою та
збільшенням не менше як в 24 рази.
Для виділення меристеми використовували добре загострені великі медичні голки
(діаметром біля 2 мм
і довжиною 10 – 15 см ).
Уколом голки в агар та плавним розрізанням голкою агару на 1А діаметра
пробірки (рухом від центру до стінки) залишали меристему в пробірці. Пробірку
закривали пробкою, і ставили у штатив.
Протягом періоду регенерації рослини меристеми через
кожні 10 – 15 днів пересаджували на нову порцію того ж середовища, або на нове
за складом середовище. Одержану рослину з 5- 6 листочками мікроживцювали
Слайд 10
Пробірки ставили у світлову із постійним світловим і волого температурним
режимом ( на рівні 24 – 25 0С, освітленість 4-12 тисячлюкс з
16годиним фотоперіодом.
Слайд 11
На 3 – 4-й день, після садіння
живців починається морфогенез – ріст
стебла і коренів. Через 20 – 25 днів рослини повністю відростають і готові для
повторного живцювання. Кількість живців із однієї рослини складає 5 – 8 шт.
Слайд 12
Під час роботи використовували середовище запропоноване двома вченими Mypacire і Скугом
Через 10 днів при повторному пересаджувані меристеми
склад середовищ змінювали: виключали гіберилінову кислоту, яка інгибує
коренеутворення, до приготованого живильного середовища вводили ауксини (ІОК)
кількістю 1мг на 1л розчину для прискорення ризогенезу. Помітили таку
закономірність: якщо концентрація ауксинів і цитокінінів в живильному
середовищі однакова або концентрація ауксинів незначно перевершує концентрацію
цитокінінів, то утворюється каллюс; якщо концентрація ауксинів значно
перевершує концентрацію цитокінінів, то формуються коріння; якщо концентрація
ауксинів значно менше концентрації цитокінінів, то утворюються бруньки, пагони.
Слайд 13, 14
Вивчення морфогенетичного потенціалу різних генотипів картоплі під дією
ауксину показало, що ранньостиглий сорт Косень - 95 характеризувався високим
коефіцієнтом розмноження –144 (коефіцієнт розмноження обчислювали діленням
вирощеного посадкового матеріалу на число маточних рослин за один рік, а потім
коефіцієнт розмноження збільшували в 2 рази), інтенсивним ростом пагонів (до 15
см у висоту) з рівномірно розміщеними листками, великою кількістю міжвузлів
(6-9) до 1,5 см завдовжки і добре розвиненою кореневою системою. За цими
характеристиками до нього наближається середньостиглий сорт Слов’янка, який
характеризувався майже таким самим коефіцієнтом розмноження 111, ріст пагонів
складав 12-14 см у висоту, також
спостерігали рівномірне листкорозміщення, наявні міжвузля (5-7), наявна
непогано розвинена коренева система.
Слайд 15
В ході дослідження інколи відмічався непрямий морфогенез in vitro – утворювались недиференційовані калюсні тканини, які
при перенесенні на середовища для індукування органогенезу, давали початок рослинам-регенерантам.
Слайд 16
При роботі з сортозразками картоплі in vitro інколи відмічали аномальний ріст рослин деяких мікроклонів, що
виявлялось в утворенні наростів на жилках стебел і листків, а також потовщень
на корінцях. Симптоми яскраво проявляються при підвищенні температури в культуральній
(«світловій») кімнаті.
Утворення наростів, що складаються
з маси калусоподібних клітин, які виходять назовні через розриви епідермісу по
жилкам стебел та листків, починається через деякий час після живцювання,
у фазі 3-4 листків. Рослини з наростами деформовані, ріст
припиняється, листки можуть обламуватись, значно знижується коефіцієнт
розмноження таких рослин.
Слайд 17
Досить часто рослини в умовах дисбалансу концентрації фітогормонів в
середовищі мають відхилення і в морфології кореневої системи.
Так, замість нормально розвиненої кореневої системи ( А) утворюється щіточка нерозгалужених
корінців, які закінчуються темними потовщеннями (Б), може відмічатись утворення рихлих «вузликів» у місці розгалуження кореня при
утворенні нормального бічного корінця (В)
або утворенням темного потовщення замість бічного корінця (Г). Рослина
з такого типу коренями частіше, пригнічується.
Слайд 18
Характерними ознаками
аномальних коренів є змінена форма кореневих волосків, які стають потовщеними і
деформованими на відміну від рівних і тонких на нормальних корінцях, а також
утворення непрозорих потовщених ділянок впродовж кореня або на його кінчику.
Слайд 19
Результати проведеного дослідження дають підстави зроботи такі висновки:
1)
Морфогенез – це
фундаментальне явище в біології розвитку організму (разом з контролем росту клітин та їх диференціюванням).
Нормальний морфогенез спостерігається тільки в цілому непошкодженому організмі
(на відміну від росту клітин та їх
диференціювання в умовах ін вітро або у пухлинах).
Морфогенез визначає форму тканин, органів
і цілого організму, а також й відносне розташування частин організму та окремих
тканин в межах організму. Фітогормони
– це біологічно активні органічні
сполуки, що виробляються в рослинах і регулюють їх ріст і розвиток.
Сьогодні різняють такі основні типи фітогормонів: ауксини, цитокініни,
гібереліни, абсцизова кислота (АБК), етилен та брасиностероїди. Проаналізовано
хімічний склад та особливості фітогормонів, а також іх вплив на явище
апікального домінування.
2)
Встановлено, що для культивування
меристем картоплі оптимальним є середовище за прописом Mypacire –
Скуга. До цього середовища додавали фітогормон ауксин (ІОК) у розрахунку 1мг/л.
Спостерігали посилення росту рослин. Так після трьох тижнів рослини сорту Слов’янка досягли
висоти 145 мм, а сотру Косень-95 – 165 мм.
3)
В ході дослідження інколи відмічався
непрямий морфогенез in vitro – утворювались
недиференційовані калюсні тканини, які при перенесенні на середовища для
індукування органогенезу, давали початок рослинам-регенерантам
4) При роботі з сортозразками картоплі in vitro відмічено аномальний ріст рослин деяких мікроклонів, що виявлялось в
утворенні наростів на жилках стебел і листків, а також потовщень на корінцях. Симптоми
яскраво проявляються при підвищенні температури в культуральнй («світловій») кімнаті.
Нарости складаються
з маси калусоподібних клітин, що виходять назовні через розриви епідермісу по
жилкам стебел та листків, починається у фазі 3-4 листків. Рослини
з наростами деформовані, ріст припиняється, листки можуть обламуватись, значно
знижується коефіцієнт розмноження таких рослин.
5) Рослини
в умовах дисбалансу концентрації фітогормонів в
середовищі мають відхилення і в морфології кореневої системи.
Так, замість нормально розвиненої кореневої системи : а) щіточка нерозгалужених корінців, які
закінчуються темними потовщеннями;
б) пухкі «вузлики» у місці розгалуження кореня при
утворенні нормального бічного корінця; в)
потовщення темного кольору (замість
бічного корінця); г) вкорочені
потовщені бічні корінці. Характерними ознаками аномальних коренів
є змінена форма кореневих волосків, які стають потовщеними і деформованими на
відміну від рівних і тонких на нормальних корінцях, а також утворення
непрозорих потовщених ділянок впродовж кореня або на його кінчику.
Аналіз літератури і власні спостереження під час роботи дозволяють
припустити, що причинами описаних
аномалій можуть бути : 1) дисбаланс фітогормонів в живильному середовищі; 2) ендофітні
бактерії, які можуть залишатись після стерилізації експлантатів під час
ініціації культури in vitro і накопичуватись в рослинах при мікроклонуванні.
У подальшому плануємо дослідити особливості процесів бульбоутворення Solanum tuberosum у культурі in vitro
Слайд 20
Дякуємо за увагу!
Наукова стаття з теми дослідження.
Єременко М. В.
Науковий керівник: кандидат
біологічних наук, доктор педагогічних наук, професор, завідувач кафедри теорії
та методики викладання природничих дисциплін Рудишин С.Д.
Явище апікального домінування :
дослідження ін
вітро на рослинах картоплі
Анотація: розглянуто явище
апікального домінування, його значення в умовах ін вітро з метою підвищення
ефективності мікроклонального размноження картоплі, залежність від специфічної дії
певного класу регуляторів росту рослин (фітогормонів) живильного середовища.
Ключові слова: апікальне домінування,
фітогормони, мікроклональне розмноження картоплі, живильні середовища.
Процеси росту і розвитку різних частин рослини взаємопов’язані між собою.
Завдяки діяльності апікальної меристеми відбувається ріст стебла у довжину, надалі
збільшується його міцність і товщина (результат камбіальної активності), що
дозволяє всьому пагону витримувати значні механічні навантаження. Апікальна
меристема як пагона, так й кореня гальмує ріст бокових меристем, пазушних
бруньок, що й одержало назву «апікальне
домінування» [1-5]. Отже, якщо видалити верхівкову меристему (верхівкову
бруньку), то її функції бере на себе найближча пазушна брунька, яка починає
рости.
Явище апікального домінування потребує комплексного дослідження із врахуванням
синергетичної дії фітогормонів (ауксинів, цитокінінів та ін.).
Метою роботи: було теоретично обґрунтувати та проаналізувати
особливості апікального домінування у рослин картоплі та шляхи використання
цього явища в умовах «ін вітро».
Для досягнення поставленої мети були визначені такі завдання:
1.
Ознайомитись
із теоретичним засадами явища апікального домінування на основі сучасних даних фізіології і біохімії рослин.
2.
Висвітлити
роль синергетичної дії фітогормонів (ауксинів, цитокінінів та ін.) у даному
явищі.
3.
Обґрунтувати
використання явища апікального домінування ін. вітро.
4.
Проаналізувати
склад живильних середовищ та їх вплив на ріст і розвиток рослин.
Дослідження проводяться
з 2014 і продовжуються на базі лабораторії мікроклонального розмноження
Глухівської дослідної станції луб’яних культур
Інституту сільського господарства Північного Сходу
Національної академії аграрних наук України.
Апікальна меристема – це саморегулююча структура, яка виконує дві функції: 1)
підтримує визначену кількість клітин у недиференційованому стані; 2) постійно
переміщує недиференційовані клітини в детерміновані, тобто чітко визначені
зачатки фітомерів. Для апікальної меристеми характерні досить дрібні
кубоподібні клітини з тонкою целюлозною оболонкою та густою цитоплазмою.
Клітини апікальних меристем називають ініціальними. Під час поділу в процесі
мітозу одна із дочірніх клітин залишається в меристемі, а інша збільшується в
розмірі і диференціюється, щоб стати постійною частиною в певних тканинах
рослини. У такий спосіб відбувається
становлення форми (габітусу) рослин [2].
Рослинна клітина багатоклітинного організму не тільки виконує функції для підтримання
власної цілісності, але й функціонує узгоджено із іншими клітинами за рахунок обміну
інформацією. При цьому одна група клітин «відправляє» сигнали хімічної природи,
а інша група клітин («мішень») сприймає їх. Серед величезного списку таких
хімічних речовин виділяють гормони рослин (фітогормони).
Вперше термін «гормон» рослин в 1909 р. запропонував німецький фітофізіолог
Г. Фіттінг (H. Fitting), за аналогією з існуванням гормонів у тварин [5].
Назва «фітогормони» узаконена в науковій і навчальній літературі, оскільки
охоплює поняття біологічно активних речовин, які здійснюють взаємодію клітин,
тканин і органів, і які у дуже малих концентраціях необхідні для запуску і
регуляції фізіологічних і морфогенетичних програм. Існує загальна назва
«регулятори росту рослин» (РРР), що активно регулюють і координують онтогенез
рослини [5].
За типом дії РРР поділяють на
стимулятори та інгібітори.Фітогормони переміщуються по рослині і впливають на ріст і
диференціацію тих тканин і органів, куди потрапляють. Таким чином, фітогормони
– це хімічні сполуки, що виробляються в рослинах і регулюють їх ріст і
розвиток.
М.Г. Холодний закладав підвалини вчення про фітогормони в той час, коли був
відомий лише один гормон рослин – ауксин. Сьогодні розрізняють такі основні
типи фітогормонів: ауксини, цитокініни, гібереліни, абсцизова кислота (АБК),
етилен, брасиностероїди. Кожна хімічна категорія фітогормонів справляє
характерний вплив на ріст і спеціалізацію клітин рослин, що використовуються ін
вітро. Проте треба чітко розуміти, що генотип рослини не змінюється під дією
будь-якого регулятора росту. РРР лише допомагають рослинам розкрити і
реалізувати їх генетичний потенціал без появи нових спадкових властивостей.
Крім того, РРР ні в якому випадку не замінюють елементів живлення.
Живильне середовище – головний фактор, що обумовлює
успіх мікроклонального розмноження. Основою усіх середовищ є мінеральні солі,
які містять необхідні для росту рослин макро- (N, Р, К, Са, Mg, S) і
мікроелементи (Fe, В, Mn, Zn, Cu, Na, Co, Mo, CI, Ni). Крім того, до їх складу
входять вітаміни, амінокислоти, фізіологічно активні речовини
[4]. Маніпуляції з концентраціями фітогормонів в живильному
середовищі дозволяє впливати на процеси морфогенезу.
Результати дослідження дозволяють зробити такі висновки:
1) Якщо наш експлант – верхівка
пагона картоплі розміром 0,20 мм завдовжки, то в пазухах його зачаткових
листочків знаходяться додаткові меристематичні тканини, які здатні формувати
нові пагони. Розвиток всіх пазухових пагонів гальмується апікальним
домінуванням. Дія підвищених концентрацій цитокінінів на відокремлений від
рослини експлант долає ефект апікального домінування в умовах ін вітро і
призводить до росту цілого пучка пагонів першого, другого, третього і т.д.
порядків. Цей процес називається проліферацією
пагонів ін вітро.
2) Утворені пагони знову пересаджують
на те саме поживне середовище для подальшого отримання нових пагонів з його
пазухових бруньок. Подібний процес можна продовжувати і отримувати велику
кількість пагонів за відносно короткий період часу.
У подальшому будемо досліджувати вплив ауксинів на етапі
укорінення пагонів ін вітро з метою одержання повноцінних рослин в пробірках.
Література
1.
Власенко
М. Ю. Фізіологія рослин з основами біотехнології / Власенко М. Ю., Вельямінова
– Зернова Л. Д., Мацкевич В. В. – Біла Церква. – 2006. – 504с.
2.
Кузнєцов В. В. Физиология растений / Кузнєцов В. В.,
Дмитриєва Г.А. – М.: Вища школа. 2006. –
504с.
3.
Мусієнко М. М. Фізіологія рослин: підручник / Мусієнко
М. М. – К. :, Либідь, 2005. – 808с.
4.
Рудишин С. Д. Основи біотехнології рослин: навч.
посіб. [для студ. вищ. навч. закл.] / Рудишин С. Д. – Вінниця: МП «ЗАПАЛ», 1998. – 224 с.
5.
Уорінг Ф.
Рострастений и дифференцировка / Ф. Уорінг, И. Філліпс; пер. с англ. Н. Л. Крячко, И. А.
Смирнова. – М.: Мир, 1984. – 512 с.
среда, 2 декабря 2015 г.
Подписаться на:
Комментарии (Atom)